稻种产地检疫
水稻种子产地检疫规程
Plant quarantine rules for producing areas of rice seeds
本规程适用于水稻种子繁育基地的产地检疫。
1 名词解释
1.1 产地检疫
系指水稻种子生产过程中的检疫。包括选择基地、选用无病良种、生长期间检查、必要的室内检验等，直到签发“产地检疫合格证书”。
1.2 检疫对象
指国家法律规定禁止随稻种、秧苗、植株残体等人为传播的危险病虫。
2 检疫对象
2.1 水稻细菌性条斑病 Xanthomonas Campestris pv. Oryzicola (Fang et al) Dye.
2.2 水稻白叶枯病 Xanthomonas Campestris pv. Oryzicola (ISHIYAMA) Dye.
3 选择基地
从未发生或连续三年未发生检疫对象，有一定隔离保护条件，灌溉水源无检疫对象污染。
4 基地用种要求
4.1 基地用种应在无检疫对象发生地区选种或经检疫部门检验证明不带检疫对象的种子。
4.2 播种前必须对种子进行消毒处理（详见附录A）。
5 综合治理措施
5.1 栽培管理要求
5.1.1 秧苗要选择在灌水系统上游，距村庄较远的地势高燥的地方。
5.1.2 捆秧苗用稻草要沸水消毒30min，或用麦草、棕叶等代替。
5.1.3 在秧田三叶期和移栽前3-5天用药剂防治1-2次。
5.1.4 灌水
5.1.4.1 排灌分家。
5.1.4.2 浅水勤灌，严防串灌、深水淹灌、浸灌，及时晒田。
5.1.5 施肥
5.1.5.1 基肥充分腐熟。
5.1.5.2 防止偏施氮肥，氮、磷、钾要合理配比，防止水稻贪青诱发病害。
5.2 病田处理
5.2.1 对发病田块和发病中心插上标记。
5.2.2 化学防治：田间一旦发现病中心，立即拔除或齐泥割除病株，喷药控制，对周围田块也应喷药预防，特别是在暴风雨及淹涝之后，要立即喷药。
5.3 病田稻种处理
5.3.1 病田生产的种子要单收、单存，严防与无病种子混杂。
5.3.1.1 轻病田(只有零星病叶)的种子必须经消毒处理后严格控制在病区使用(种子消毒处理方法见5.2条)。
5.3.1.2 其它病田种子一律改做粮食不准作种用。
5.4 病稻草处理：病稻草作燃料烧掉，或作其他灭菌处理。不得用病稻草捆秧和禁止带病肥料施入稻田。
6 检查、检验方法
6.1 田间检查
6.1.1 田间检查时间
6.1.1.1 秧田从四叶期开始，逐畦目测检查，发现可疑病斑，拔出病苗，进行鉴定。
6.1.1.2 本田期检查三次：第一次在拔节期；第二次在孕穗至抽穗阶段，多为病害流行时期，症状明显，易于识别；第三次在齐穗后至叶片枯黄前，结合种子纯度、质量检验同时进行。
6.1.2 田间检查方法
6.1.2.1 检查方法：种子田逐块、逐带检查（包括隔离区）。
6.1.2.2 症状诊断：田间症状识别（详见附录B）。可疑症状，采集标本带回室内鉴定。
6.2 室内检验方法
6.2.1 细菌溢检查：切取病叶上病健交界处叶片组织约1毫米，放在载玻片的水滴中，加上盖玻片，静止1-2min后，用手持扩大镜或低倍显微镜稍暗视野下检查，有云雾状菌液自叶脉涌出。
6.2.2 保湿检查：取玻璃杯一只，内盛清洁河沙约半寸深，加水湿润，再切取病叶组织约6.6cm，下端插入河沙中，上端外露，加盖湿纱布，保湿12h以上，上端切口处有混浊液或淡黄色菌珠形成。
6.2.3 染色检查：将病叶茎部剪去，插入盛有红墨水（原液或加稀释）的玻管或广口瓶中，放在通风而温暖的地方，30min后，健部染成红色，病部因导管内充满细菌，影响红墨水进入，仍为绿色或黄色。
6.2.4 分离培养检验：对病组织进行分离培养细菌学检验（详见附录C）。
6.3 带菌种子检验：用噬菌体方法或免疫荧光检验方法检验种子带菌情况（详见附录D）。
7 签发证书
7.1 经最后一次田间检查后，未发现检疫对象的水稻种子，由当地检疫部门签发“产地检疫合格证”（见附录E）。
7.2 凡发生有检疫对象的种子田生产的种子不发给“产地检疫合格证”。
7.3 种子部门凭“产地检疫合格证”收购无病种子。
附录A
水稻种子消毒处理方法（参考件）
A1 细菌性条斑病、白叶枯病。
A1.1 热水烫种：将稻种盛在箩筐内，先放到45℃的温水中预热3min，立即移入保持58℃的热水中浸泡10min。将稻谷取出后立即用冷水冲洗冷却再浸种催芽或晒干待播。
A1.2 80%“402”1000倍（或10%“401”500倍）+0.4%盐酸（化学纯）浸种36h。（注：根据大田应用结果，浸种时间36h比较安全。实际应用时，各地应对不同品种作发芽试验后，方可应用）。
A1.3 氯霉素500ppm浸种48h（水温25-28℃）。
附录B
田间症状识别（补充件）
B1 水稻细菌性条斑病
水稻细菌性条斑病在叶片上形成暗绿色或黄褐色的狭窄条斑。初发期为暗绿色水渍状半透明小斑点，很快在叶脉之间伸展，形成宽约1/3-3/4mm，长约1-4mm的条斑，可扩大到宽1mm、长10mm以上，转为黄褐色。病斑上带有成串的黄色珠状细菌溢出，形小而量多。严重时，病斑增多而融聚一起，局部呈不规则的黄褐色至枯白斑块，对光观察，病斑部半透明，水浸状。病部菌胶多，色深，不易脱落。秧苗期即可见到典型症状。
B2 水稻白叶枯病
B2.1 典型白叶枯病症状
典型白叶枯病症状主要发生在叶片及叶鞘部位，病菌自叶片的叶尖或叶缘入侵后先产生黄绿色、水渍状条斑纹斑点，后沿叶缘一侧或两侧，或叶片中脉继续发展成为波纹状黄色、黄绿色或灰绿色病斑；病、健组织界线明显，病斑数天后转灰白色，并向内卷曲，远望一片枯槁色。在空气湿度大或雨后的傍晚和清晨露点大时，病叶上的新鲜病斑上，有时甚至在未表现病斑的叶缘上吐出混浊状的水珠或蜜黄色胶珠状的细菌脓，干涸后硬结成粒，易脱落。在一些感病品种上，病斑可以从叶片向下扩展至叶鞘，如黄白色转为灰白色，叶鞘最终亦呈干枯。
B2.2 雕萎型白叶枯病症状
雕萎型白叶枯病症状主要发生于秧田及移植前后，幼株感病后，在秧苗生育后期或本田移植后1至4周内，能陆续表现症状。症状的产生主要是病原菌自叶面伤口、自然孔口、伤茎或断根等部位入侵，在稻田内沿维管束向其他器官部位转移，分泌毒素破坏并堵塞输导组织而引起秧田失水，整株雕萎。雕萎株发生前期，病菌的入侵点（叶尖水孔或伤口）上先出现水渍状灰绿色急性型病斑，而后迅速沿主脉向下扩展至叶鞘，感病叶片及叶鞘很快干枯，甚至死亡脱落，7-10天后便出现雕萎株、心叶卷曲、形似螟害枯心，但只要把枯萎株拔起，剥开枯萎心叶，剖视病株假茎褐变部位，并用手挤压断口，可见大量黄白色至黄色涕状菌脓溢出，剥视病株叶鞘内侧，亦常见有大量菌脓溢出。病菌如从茎部或断根以及自根点伸长的新根所穿破的鞘部伤口入侵时，能迅速直接入侵心叶或假茎组织。雕萎出现早，茎部叶片或心叶都可因症状发展严重而先后卷曲；但有时往往在伸长的心叶上伤口处出现叶枯型病斑。雕萎症状与典型白叶枯症状可以相互转化，单独发生或同时并发。
B2.3 黄叶型症状
黄叶型症状多见于成株上的心部新叶，得病后呈淡黄至青黄色；而其他下位叶片呈正常绿色。在黄叶型的病叶上，一般难以检出细菌；但在感染的叶片下方的节间及假茎部则大量带菌，在尚未足以破坏茎节的输导组织时，仍能为幼叶供应少量养分，致使叶片呈半死不活的淡黄色状态。
附录C
细菌学检验方法（补充件）
水稻白叶枯病菌和条斑病菌的分离方法与一般植物病原细菌的分离方法相同，只是在培养基中以蔗糖代替葡萄糖，分离后的培养皿先在20-25℃温箱中存放一天后转入27-29℃的温箱中培养，而菌落的出现一般都要3-7天以后。
在细菌的生理化反映方面，条斑病菌与白叶枯病菌基本相似，但有几个显著区别：（1）明胶液化：白叶枯病菌不能液化；条斑病菌能液化明胶。（2）牛乳培养：白叶枯病菌不能胨化，条斑病菌可以胨化。（3）阿拉伯糖发酵：白叶枯病菌不能利用，不产酸；条斑病菌可以利用而产酸。（4）白叶枯病菌对还原物质敏感，在2%葡萄糖的培养基上不能生长；条斑病菌对还原物质不敏感，在2%葡萄糖培养基上可以生长。（5）两者的血清反应和噬菌体反应各不相同。
附录D
带菌种子的检验法（补充件）
D1 噬菌体检验法
D1.1 检验时间：被检验稻种在收获后的三个月内进行。
D1.2 样品的制备：多点取样稻种，经充分混合后随机称取10g种子，脱下谷壳，磨碎后放入消毒过的烧杯或研钵中，加灭菌水20mL，浸泡并时常搅拌，半小时后吸取上层清液供测定用，也可用粗滤纸过滤除去组织残余，取滤液测定。
D1.3 指示菌液的制备：使用OS-3（江苏）和OS-14（辽宁）两个菌株作混合指示菌（各地在检验本地种子材料时，也可用本地的菌种），要保证指示菌的纯度，指示菌要使用新鲜培养的，尤以斜面培养的为好，一般以移植在斜面上生长3-5天的菌为最好，超过10天以上的不宜使用。指示菌悬浮液浓度不宜过稀，以每毫升含菌量在9亿以上为好。在每管斜面菌种管中，加5mL灭菌水，刮下菌苔，配制成细菌悬浮液，作测定用。
D1.4 测定及计数：每个样品，分别吸取上层溶液1.0、1.0、0.5mL于三个灭菌培养皿中，各加1mL指示菌液和10mL溶化的固体培养基，摇匀凝成平板后，放在25-28℃的温箱中，培养10-12h后，记载各个培养皿中的噬菌斑数，然后再换算成每克种子内的噬菌斑数。
D2 荧光抗体检验法
D2.1 荧光抗体法检验水稻白叶枯病种操作程序
D2.1.1 荧光片的制备
D2.1.1.1 称取5g干稻种（最好收获后一年以内），脱壳备用。
D2.1.1.2 将稻壳放在大试管内，加生理盐水10-15mL，以没过稻壳为准，用玻棒搅匀，放28℃温箱孵育2h。
D2.1.1.3 将稻壳水搅拌后滤出弃壳，稻壳水放离心管内，以1000r/min离心5min，弃去沉淀物，留上清液。
D2.1.1.4 将上清液放离心管内，以4000r/min离心30min，用吸管弃去上清液，留底部富集菌液0.5mL。
D2.1.1.5 以富集菌液在载片上涂去，阴干并在酒精灯火焰上迅速过1-2次，使菌固定于载片。
D2.1.1.6 用1：10-15白叶枯抗血清盖满载片上细菌涂片区，将载片水平放在37℃密闭水溶箱内，保湿30min。
D2.1.1.7 取出上项载片，用磷酸缓冲出多余的抗血清，然后阴干或用吹风机吹干。
D2.1.1.8 在上项载片细菌涂片区加滴1：15羊抗兔荧光抗体，盖满涂片区，水平放37℃水溶箱30min同前。
D2.1.1.9 取出载片、用磷酸缓冲液冲洗荧光抗体，阴干或吹风机吹干载片，备用。
D2.1.2 荧光片的检验（在暗室内进行）
D2.1.2.1 在荧光片涂菌区滴一滴pH为8的缓冲甘油（或无荧光镜油）。
D2.1.2.2 用荧光显微镜100X物镜对准载片涂菌区，小心地使镜头接触到玻片。
D2.1.2.3 观察目镜，用细调螺旋使物镜缓缓上移，待目镜中较明亮时，注意观察在暗景载片上有黄绿色明亮菌体，选10个点统计白叶枯菌体（短杆状，较粗肥）（种子带菌量与田间发病关系须进一步研究）。
注：稀释抗血清和荧光抗体用0.8%灭菌的生理盐水。
D2.2 试剂配方
D2.2.1 pH8.0缓冲甘油（无荧光镜油的代用品）
5份甘油（一级规格）+1份pH8.0浓度0.01M磷酸缓冲液混匀，放冰箱内保存。
D2.2.2 0.01M pH8.0磷酸缓冲液配方
原液：0.2M磷酸缓冲液配方如下：
15.6g磷酸二氢钠（含2个结晶水）溶于500 mL水中。
35.82g磷酸氢二钠（含12个结晶水）溶于500mL水中。
D2.2.2.1 5.3mL。
D2.2.2.2 94.7mL。
氯化钠17g加水至2000mL即为0.1M，pH8.0的磷酸缓冲液，必要时用0.5M碳酸钠校正pH值。
附加说明：
本标准由全国植物保护总站、陕西省植物保护工作总站、广东省植物保护总站负责起草。
本标准主要起草人耿秉晋、王春林、张培禾、曾栋声、尹凯峰。
